铜绿假单胞菌是一种常见的条件致病菌，我国矿泉水、包装饮用水、化妆品等均需要进行该菌的检验，涉及检验标准为GB 8538-2016 《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》、《化妆品安全技术规范》、GB7918.14-1987《化妆品微生物标准检验方法》等。检验铜绿假单胞菌我们不得不提荧光假单胞菌，其常作为检验过程中的阴性对照菌株。今天我们就一起来了解下铜绿假单胞菌以及他的这个同门师兄弟—荧光假单胞菌。
显微镜下如此相似的菌种，到底有什么不同呢？这些不同又怎么指导我们进行日常的微生物检验呢？
别急！我们先从菌株活化开始。
提到菌株活化，在座的看官们一定认为，So easy! 36℃，TSA，24h，有氧培养！这个我们经常操作，一定没问题的！可是一上手操作，24h后从36℃培养箱里拿出来一看，没长？抑或只长了少量菌落？
此时的您是不是第一想到的是这个菌一定有问题！事实是什么呢？我们先看看标准的操作方法吧！
嗯，温度出错啦！记得30℃以下才能让我们荧光假单胞菌活化出来哦！看看比对的结果吧！
荧光假单胞菌活化于TSA平板
菌株已经准备就绪，那我们继续看看荧光假单胞菌与铜绿假单胞菌在培养过程中的差异。
先从平板开始说起：
假单胞菌CN琼脂：我们可以看到铜绿假单胞菌，36℃培养生长良好，为蓝绿色菌落；荧光假单胞菌在CN琼脂上36℃生长较弱，25℃生长良好，且为淡黄色菌落，置于365nm紫外灯下观察荧光反应，荧光假单胞菌荧光明显。
十六烷三甲基溴化铵琼脂：铜绿假单胞菌36℃培养，生长良好，为黄绿色菌落，而荧光假单胞菌36℃未生长，25℃生长良好，且为淡黄色菌落。
乙酰胺琼脂：铜绿假单胞菌生长利用乙酰胺产生碱性代谢产物，使得培养基颜色变为玫红色，而荧光假单胞菌36℃不生长，于25℃培养生长良好且未产生碱性物质则培养基不变色。
看了上面的结果，您一定想说“荧光假单胞菌在36℃不生长，没有必要用它做为阴性对照了！”其实也不能断然下结论，我们接着往下看！
将荧光假单胞菌于TSA中，25-30℃培养，得到生长良好的纯菌落，以用于后续生化鉴定实验的阴性对照。
硝酸盐产气实验《化妆品卫生规范》
硝酸盐还原试验是根据某些细菌能还原硝酸盐。并将亚硝酸盐分解产生氮气，观察硝酸盐胨水培养基内的小导管中有气体者，即为阳性。铜绿假单胞菌应呈阳性，荧光假单胞菌呈阴性。从实验结果我们可以看到铜绿假单胞菌出现明显产气现象，荧光假单胞菌在28℃和36℃均可正常生长，并呈现阴性反应。
明胶液化实验
明胶是肽分子聚合物质，是胶原蛋白多级的水解产物，溶点在24-28℃之间，即在低于溶点时明胶处于固体状态。部分细菌可以产生胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，变为流动的液体状态。操作时，将新鲜活化的菌株穿刺接种于明胶培养基中，置于相应温度下培养，培养结束将培养物置于2-8℃冰箱冷藏，30min后进行观察，若培养物为流动状态说明明胶液化阳性，若为凝固状态则为阴性。铜绿假单胞菌为阳性，荧光假单胞菌为阴性。
明胶液化实验
（荧光假单胞菌28℃培养-荧光假单胞菌36℃培养-铜绿假单胞菌）
乙酰胺还原实验
乙酰胺肉汤中的主要成分为乙酰胺，微生物代谢分解乙酰胺酶将乙酰胺分解，产生NH4+；钠氏试剂主要成分为氯化汞（HgCl2）和碘化钾（KI），化学反应式如下：
钠氏试剂：HgCl2+2KI==2KCl+HgI2；
钠氏试剂与NH4+反应：
我们肉眼看到的红色的沉淀就是HgO·Hg(NH2)I，这个反应非常快，所以观察结果时在培养物中滴加钠氏试剂后在10s内观察结果。铜绿假单胞菌乙酰胺还原反应阳性；荧光假单胞菌还原反应阴性。
为了保证结果的准确性，操作过程中可以挑取菌落接种以加大接菌量，并且培养时间要充分，以保证得到大量的代谢产物！
乙酰胺肉汤实验（滴加钠氏试剂前）
空白-荧光假单胞菌28℃培养 –荧光假单胞菌36℃培养 -铜绿假单胞菌
乙酰胺肉汤实验（滴加钠氏试剂后）
绿脓菌素测定实验：
绿脓菌素是铜绿假单胞菌代谢产生的胞外次级代谢产物，部分有机溶剂可促进绿脓菌素的产生，其可发生可逆的氧化还原作用，碱性条件时呈氧化型蓝色，酸性条件时呈还原型红色。在进行绿脓菌素测定时，若该菌可代谢产生绿脓菌素，向培养物中加入三氯甲烷使得色素溶出，再继续滴加1mol/L盐酸，可出现肉眼可见的红色还原型产物。
铜绿假单胞菌若产生绿脓菌素，培养物为蓝绿色，加入氯仿后溶液呈淡蓝色，继续滴加1mol/L盐酸，溶液表面出现红色。荧光假单胞菌并不能出现上述反应，为阴性。
铜绿假单胞菌+氯仿+盐酸后绿脓菌素测定实验
看完生化反应结果，您是否明白了，虽然荧光假单胞菌在部分培养基中36℃生长较弱，但是并不影响他参与生化反应的对照作用，在以上生化鉴定过程中，荧光假单胞菌在36℃生长良好，并呈阴性反应。
所以如果您想看到平板上的阴性对照反应，可以把平板置于30℃以下培养，如果是微量生化鉴定反应可以和样品及阳性对照一同放入36℃进行培养即可。
（说明：本次实验图片中菌株来源：铜绿假单胞菌 CMCC 10104；荧光假单胞菌 CICC 21612）
铜绿假单胞菌检测用培养基列表
参考文献
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