想了解哪些食品易受蜡样芽孢杆菌的污染吗？想知晓国内外关于蜡样芽孢杆菌的限量标准吗？想掌握蜡样芽孢杆菌检验关键环节--蛋白质毒素结晶的染色方法吗？这篇文章会给你想要的答案。

蜡样芽孢杆菌简介

     蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是芽孢杆菌属的一员，为兼性厌氧的革兰氏阳性芽孢杆菌，广泛存在于土壤、尘埃、空气和植物等自然环境中。

查阅文献发现易受蜡样芽孢杆菌污染的食品包括米饭或淀粉类制品、乳制品、水果制品等。值得注意的是，该菌污染的食物在感官上无明显变化，不易被察觉，当在食物中大量繁殖产生肠毒素被误食时会引起食物中毒，表现为恶心呕吐或腹痛腹泻。据统计我国1973-2013年的食物中毒事件中，由蜡样芽孢杆菌引起的中毒事件占比12.95%，位居第二。

在日常饮食中为了保障食品安全，在室温较高时，米饭及淀粉制品应选择冷藏保存，避免蜡样芽孢杆菌的繁殖。此外，生食的蔬菜和水果应认真清洗后食用。

蜡样芽孢杆菌的限量标准和检验标准 

目前，我国大陆地区缺乏即食食品中蜡样芽孢杆菌的限量标准。下表列出其他国家、中国香港和澳门地区的限量要求，希望为您制定产品的限量标准提供技术依据。澳大利亚和新西兰标准可接受水平为10²~10³ CFU/g，英国和中国香港标准可接受水平为10³~10⁵CFU/g，中国澳门标准可接受水平为10³~10⁴ CFU/g。

我国食品中蜡样芽孢杆菌的检验依照标准GB 4789.14-2014《食品安全国家标准 食品微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验》进行，包括平板计数法和MPN计数法，主要检验步骤为样品稀释、接种、分离培养、纯培养、染色镜检和生化鉴定。

有文献报道称，蜡样芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）和炭疽芽孢杆菌（Bacillus anthracis）具有高度的DNA同源性，共同构成了蜡样芽孢杆菌群（Bacillus cereus group species），在形态学和生理生化反应方面极其相似，如此便为蜡样芽孢杆菌的鉴定带来了难度。

无论选择生化鉴定试剂盒还是全自动细菌鉴定系统（如VITECK-2）进行蜡样芽孢杆菌的鉴定，若要区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽胞杆菌，均需进行蛋白质毒素结晶试验。产生蛋白质毒素晶体是苏云金芽孢杆菌区别其他芽孢杆菌的重要依据。苏云金芽孢杆菌是当前研究最为深入、应用最为广泛的微生物农药，其杀虫的机理就在于芽孢形成期产生的具有杀虫活性的蛋白质毒素结晶，昆虫食入后，引起肠道细胞发生肿胀或自溶，导致虫体死亡。

蛋白质毒素结晶染色方法 

接下来就是介绍蛋白毒素结晶染色方法和心得体会的时候了。

01 菌株的培养

将待鉴定菌株接种于硫酸锰营养琼脂平板上，30 ℃±1 ℃培养24 h±2 h。

02 室温放置

将培养物于室温放置3 d~4 d，待芽孢和蛋白质毒素结晶的形成。若染色发现游离芽孢形成的不丰富，可继续放置2 d~3 d再染色镜检。

将培养物逐天染色镜检发现，放置至D5时，观察到游离芽孢和蛋白质毒素结晶，但不丰富，需切换视野进行寻找。随着放置时间延长，蛋白质毒素结晶逐渐丰富。直到放置至D10，视野中布满了蛋白质毒素结晶。不同菌株间在芽孢和蛋白质毒素结晶形成时间上存在差异。

03 染色

A  挑取少量培养物于载玻片上，滴加一滴蒸馏水混匀并涂成薄膜（同革兰氏染色）。

B  经自然干燥，微火固定（同革兰氏染色）。

C  加甲醇作用30 s后倾去，再通过火焰干燥。

D  于载玻片上滴满0.5%碱性复红，用镊子夹取载玻片放于酒精灯火焰上加热1 min～2 min。

控制好载玻片与火焰的距离，以达到“微见蒸汽，勿使染液沸腾”的效果。若加热过度，染液干涸在载玻片上，后续难以彻底清洗，不利于镜检观察。尝试滴加染液后于室温放置30 min，染色效果满意，若把握不好加热效果，此方法值得一试。

E  倾倒染液，更换染液后再次加温30 s，倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干。

04 镜检

镜检观察有无游离芽孢（浅红色）和染成深红色的菱形蛋白质毒素结晶。除苏云金芽孢杆菌外，其他芽孢杆菌不产生蛋白质毒素结晶。下图中红色箭头标记为蛋白质毒素结晶，蓝色箭头标记为游离芽胞，黄色箭头标记为菌体。

苏云金芽孢杆菌蛋白质毒素结晶染色镜检（放置5天和10天）

参考文献

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