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革兰氏染色
在很多微生物检验标准中都会涉及到染色镜检这一步，其中绝大部分都是指的革兰氏染色。
原理
革兰氏阳性细菌细胞壁主要由肽聚糖形成的致密网状结构组成，壁厚，类脂含量低，交联度高，用乙醇处理后，发生脱水作用，肽聚糖层孔径缩小，通透性降低，从而使结晶紫-碘复合物不易被洗脱而保留在细胞内，故细菌仍保留初染时的紫色。
革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖层较薄，交联度低，含较多类脂质，故用乙醇处理后，类脂质被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，细胞被脱色，经沙黄复染后呈红色。
染色步骤
革兰氏染色注意事项
1.选用活跃生长期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌细胞壁通透性发生改变容易被染成红色而造成假阴性。
2.涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
3.脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
样品中分离芽孢杆菌的革兰氏染色
（紫色为菌体，芽孢无法着色）
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结晶紫染色
《GB 4789.26-2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 商业无菌检验》中还涉及到一种染色方法：结晶紫单染色。
结晶紫是一种碱性染料，能够将细胞质内核酸染色。结晶紫单染色通过结晶紫染色液进行染色，使微生物细胞与背景形成鲜明的对比，易于在显微镜下观察菌体的一般形态。
01
涂片
针对商业无菌检验时，涂片方法为----带汤汁的样品，可用接种环挑取汤汁涂于载玻片上，固态食品可直接涂片或用少量灭菌生理盐水稀释后涂片，待干后用火焰固定。油脂食品涂片自然干燥并火焰固定后，用二甲苯流洗，自然干燥。
对于一般微生物的结晶紫单染色，涂片方法可参考革兰氏染色。
02
染色
将涂片在酒精灯火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。
03
镜检
针对商业无菌检验时，应至少观察 5 个视野，记录菌体的形态特征以及每个视野的菌数。与同批冷藏保存对照样品相比， 判断是否有明显的微生物增殖现象。菌数有百倍或百倍以上的增长则判为明显增殖。
混合微生物菌体的结晶紫单染
(大椭圆为酿酒酵母ATCC9763，杆菌为大肠杆菌ATCC25922，球菌为金黄色葡萄球菌ATCC6538)
3
芽孢染色
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料亲和力不同的原理，用不同的染料进行着色使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区分。
试剂
5%孔雀石绿染色液----给芽孢染色，使芽孢呈绿色；
沙黄染色液----给菌体染色，使菌体呈红色。
芽孢染色的方法大家可以查看我们之前的推文“芽孢染色方法介绍”。在这篇文章中我们详细地介绍了传统的芽孢染色操作方法，并且对其操作方法进行了改良，使其更便于操作，大家不妨看一看。
芽孢染色镜检图片
（红色为菌体，蓝绿色为芽孢）
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蛋白毒素结晶染色
在《GB 4789.14-2014 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》标准中，我们需要做革兰氏染色镜检，在此基础上也可以做芽孢染色。除此之外，蛋白毒素结晶染色也是我们绕不过去的一道坎。
蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌除了用蛋白毒素结晶染色外，以生化鉴定的方式是无法将它们区分开的。所以蛋白毒素结晶染色对于蜡样芽孢杆菌检验来说也是很关键的一步。
培养基：硫酸锰营养琼脂----用于培养菌体，其有利于苏云金芽孢杆菌蛋白毒素结晶的产生；
试剂：甲醇、0.5%碱性复红染液
小伙伴们如果不会做蛋白毒素结晶染色的话，那就来看看“蜡样芽孢杆菌检验，知多少？”这篇文章吧。相信大家看完这篇文章，做起蛋白毒素结晶染色来肯定就得心应手了。
蛋白毒素结晶染色镜检图片
（红色箭头所指为蛋白毒素结晶，蓝色所指为芽孢）
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