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沙门氏菌检验流程详解(一)

发布时间: 2021-12-02

年终岁末,重磅福利!

多少个日夜,我们被沙门检验的复杂流程搞的头晕脑胀!

多少次回首,我们被沙门检验的干扰菌株搞的身心俱疲!

不要彷徨,不要迷茫。

陆桥技术部为微生物检验员倾力打造《沙门氏菌检验流程详解》系列文章。

通过原理帮您照亮检验流程中隐秘的角落。

通过近50张照片帮您突破沙门干扰菌造就的重重迷雾。

从此天堑变通途。

由于文章内容过于丰富,篇幅过长,故分四期给大家呈现。

本期主要带大家认识沙门,并揭示增菌的秘密。

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沙门氏菌简介

沙门氏菌属(Salmonella)是一群寄生在人类和动物肠道中,生化反应和抗原结构相关的革兰氏阴性杆菌。沙门氏菌属细菌的血清型现已达2500多种。根据DNA同源性,分两个种,即肠道沙门菌(S.enterica)和邦戈沙门菌(S.bongori)。肠道沙门菌又分6个亚种,能感染人类的沙门菌血清型,约1400多种,主要在第一亚种,即肠道沙门菌肠道亚种(S. enterica subsp. Enterica)。


沙门氏菌属中少数血清型如伤寒沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌和丙型副伤寒沙门氏菌是人的病原菌,对人类有直接的致病作用,引起肠热症,对非人类宿主不致病。绝大多数血清型宿主范围广泛,家畜、家禽、野生脊椎动物以及冷血动物、软体动物、环形动物、节肢动物(包括苍蝇)等均可带菌,其中部分沙门氏菌是人兽共患病的病原菌,可引起人类食物中毒或败血症。



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沙门氏菌的生物学特性



2.1 形态与染色



革兰氏阴性杆菌,大小(0.6-1.0)μm×(2-4)μm。有菌毛。除鸡沙门菌和雏鸭沙门菌等个例外,都有周身鞭毛。一般无荚膜,均无芽孢。


沙门氏菌检验流程详解(一)



2.2 生化反应与培养特性



兼性厌氧菌,营养要求不高,在普通琼脂平板上可生长。不发酵乳糖或蔗糖,能发酵葡萄糖、麦芽糖和甘露糖。除伤寒沙门菌产酸不产气外,其他沙门菌均产酸产气。


2.3 抵抗力




沙门菌对理化因素的抵抗力较差,湿热65℃、15-30min即被杀死。对一般消毒剂敏感,但对某些化学物质如胆盐、煌绿等的耐受性较其他肠道菌强,故用作沙门菌选择培养基的成分。本菌在水中能存活2-3周,粪便中可存活1-2个月,在冰中能存活更长时间。



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沙门氏菌检验流程

(GB 4789.4-2016)


所有定性检验的流程都是层层筛选的,每层都排除一些非目标菌,这样最后得到的就是我们要检的目标菌。在方法建立的时候,每一步试验都是经过验证的,所以检验过程中不能跳步。沙门氏菌检验是所有定性检验项目中步骤最全的,包括样品处理、预增菌、选择性增菌、选择性分离、纯化、生化鉴定和血清学鉴定。比如我们就不能越过生化鉴定,直接做血清学鉴定,那样会很容易出假阳性。现在我们就从第一步开始给大家介绍一下沙门氏菌的检验。


沙门氏菌检验流程详解(一)


3.1 样品处理及预增菌



无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mL缓冲蛋白胨水(BPW)的无菌均质杯、均质袋或合适容器内,根据标准要求进行均质。若样品为液体,即可以均质,也可以震荡混匀。于36℃±1℃培养8h-18h。


样品处理时注意避免样品间交叉污染;均质袋与均质器的组合是目前常用的均质方式;BPW的预增菌对沙门氏菌检验尤其重要,因为食品加工中采用的各种工艺(冷冻、加热、干燥、高盐等)使得菌体细胞不同程度地受损,受损的菌株会漏检,在食品存放过程中自我修复后能引起人的疾病。BPW为非选择性的增菌培养基,培养过程中缓冲体系能将培养基维持在较高pH,有利于受损细胞的恢复。BPW具体原理请参考陆桥官网缓冲蛋白胨水(BPW)

沙门氏菌检验流程详解(一)沙门氏菌检验流程详解(一)


3.2 选择性增菌



将培养后BPW摇匀,取1mL转种于10mL 四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB),于42℃±1℃培养18h-24h,同时再取1mL转种于亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC),于36℃±1℃培养18h-24h。


TTB增菌液的配制有两个注意事项,一是碳酸钙是TTB的正常成分,作用是中和吸收有毒性的代谢物质(主要是培养基酸碱度的变化对菌生长的影响)。但是碳酸钙不溶于水,所以TTB有沉淀是正常的,分装时一定摇匀分装。二是四硫磺酸钠是TTB抑制性的核心成分,培养基也以此命名,但成分表中并没有四硫磺酸钠,它是在碘液煌绿加入后,硫代硫酸钠经碘氧化生成的。四硫磺酸钠对大肠菌群有抑制作用,但不稳定,所以碘液和煌绿必须在临用前加入。具体原理可以参考陆桥官网四硫磺酸钠煌绿增菌液(TTB)


沙门氏菌检验流程详解(一)



SC增菌液配置时若过度加热,或存放时氧化吸潮,则溶液易出现砖红色沉淀,此时培养基不能使用。原因是亚硒酸盐被氧化失效,选择性下降。若SC增菌液接种时为淡黄色溶液,培养后呈砖红色,这属于正常现象,说明增菌液中有细菌大量增殖。具体原理可以参考陆桥官网亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)

沙门氏菌检验流程详解(一)



为什么TTB和SC要求同时使用呢?


根据资料显示,伤寒沙门氏菌不能在TTB上生长,可以在SC上正常生长,所以两种培养基具有一定互补性。我们将几种常见沙门氏菌标准菌(伤寒、鼠伤寒、肠炎沙门等)分别微量接种TTB和SC,发现只有伤寒沙门氏菌在TTB上基本澄清,而SC上明显浑浊,与资料描述基本一致。伤寒沙门氏菌只是我们发现的其中一种,由于沙门氏菌的种类繁多,为了避免漏检,两种培养基一定要同时使用。

沙门氏菌检验流程详解(一)























沙门氏菌检验流程详解(一)


好了,今天的介绍就这些。下期给大家带来BS琼脂和XLD琼脂。


敬请期待。。。。




To be continued






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