感谢各位老师参与11月17日的陆桥公益直播课《2022版国标食品中叶酸和维生素B12微孔板法测定解析》，如您未能及时聆听，我们已设置回放，有效期一周（至2022年11月27日） 。

       期待您再次参与陆桥的直播课。

直播课问题解答

1. 叶酸标准曲线制作几平行？

根据2022版国标最新要求，叶酸是2-3平行，维生素B₁₂是3平行。

2. 标准系列管怎么混匀？

标准系列管各组成溶液添加完毕后，用涡旋振荡器混匀。

3. 试管法有试剂盒吗？

有试管即用型试剂盒，分别是叶酸(GVT1001)、维生素B₁₂(GVT1002)、生物素(GVT1003)和泛酸(GVT1004)。

4. 容量瓶需要定期检定吗？

需要，GB/T 27405-2008《实验室质量控制规范 食品微生物检测》标准中明确规定需要对定容设备定期检查以确保其准确度。

5. 有时强化食品生产企业会在标注量上故意多添加一些，这种情况下该如何估算？

第一次做此类样品只能预估含量，适当多选几个稀释倍数。后续有经验了，可根据经验预估含量。

6. 标准系列管最后高浓度的几个点不稳定有什么可能的原因？

原因较多，可以重点看标品配制的准确性和添加的准确性，特别是移液枪的准确度。

7. 请问您用试管的多管法紫外分光光度计测定标准曲线选几次曲线？国标里面没有明确规定，也没有对线性做明确要求。

国标对标准曲线的拟合方式没有明确要求，实验室内部统一即可。我们一般用二次多项式曲线拟合。

8. 国标法叶酸培养基灭菌以多少毫升为宜？以前做过会发生褐变。

培养基用量根据实验样品数量来定，一般灭菌后要及时从高压锅中取出，立刻降温，避免过度加热。

9. 按含量选择稀释倍数但是还是超标曲，为什么呢？

一般是因为样品的实际含量高于样品标签值，建议按经验含量值预估稀释倍数。

10. 玻璃器具浸泡可以只用洗涤剂浸泡吗，需要浸泡多久？

2022版国标上明确写可以用盐酸或月桂基磺酸钠洗涤剂浸泡，但未明确浸泡时间。2014版国标上要求盐酸浸泡2小时。我们目前还是浸泡2小时。

11. 盐酸浸泡，盐酸浓度有要求不？

国标上试剂配制里有写，例如叶酸在国标3.2.5条款中要求“量取100mL盐酸（浓度36%-38%）与50倍水混合”。

12. 培养基用什么盛装灭菌？如何混匀？

用三角瓶就可以，灭菌前通过玻璃棒搅拌或浸泡方式充分溶解。

13. 曲线达到多少算合格呢？

国标上没有明确要求。我们自己一般用二次多项式曲线拟合，R²值一般0.99常见，最低要求0.97。

14. 酶解法，如何进行预估比较合理？

酶解法处理的是原生样品，可查阅相关资料获取含量范围或通过预实验先摸索含量。

15. 标准曲线需要0.999吗？

维生素实验3个9很难实现。我们自己一般用二次多项式曲线拟合，R²值一般0.99常见，最低要求0.97。

16. 维生素B₁₂国标方法计算公式能麻烦讲解一下么？

维生素B₁₂国标计算公式中只有一个f，没有像叶酸一样写明是V×f，所以维生素B₁₂的f实际就是V和f的乘积结果。

17. 5mL不含叶酸的标准工作液是什么？

应该是5mL不加叶酸标准工作液的无菌叶酸测定培养基，其实就是叶酸测定培养基。

18. 曲线为什么会飘点呢？

要结合具体数据才能分析，一般来说与标品配制的溶解和添加准确性有关系。

19. 维生素B₁₂过滤的样品用都过滤完吗？

不需要，只要过滤出需要的量就可以了。

20. 微孔法数据处理是我们蝴蝶软件吗？怎么用的呢？

Excel和蝴蝶软件都可以，蝴蝶软件用法不变，只有稀释度那里需要根据实际稀释倍数进行调整换算。

21. 更新版的陆桥维生素B₁₂培养基颜色方面有改进吗？

2022版国标对培养基成分没有调整，所以我们培养基配方不会改变，还是与国标保持一致。

22. 叶酸计算公式C₀ 是接种空白吗？一定要扣除零点吗？国标里的公式没有明确标注要扣零点。

C₀ 是酶解法公式中的参数，是酶空白测定的值。一般常用的直接提取法是不会用到这个参数的。

23. 莱士曼氏乳杆菌不太稳定，有什么好的保存方法？

我们实验室菌株长期保藏用-80度甘油法，一个月内保藏放2-8℃冰箱，叶酸和生物素的菌株可以平板直接放入冰箱，维生素B₁₂ 的莱士曼乳杆菌需穿刺培养后，放入冰箱。

24. 同样的培养基，同样的菌株活化方法，维生素B₁₂国标法长但微孔板不长是什么原因呢？

微孔板法的培养体系是300μl，远小于试管法的10mL。所以对标准品的混匀程度，菌活力、浓度及菌的混匀程度，各级溶液的混匀，移液枪的准确度都有更高的要求。建议从这些方面排查原因。

25. 新版维生素B₁₂国标方法的计算公式单位最后怎么换算成μg/100g？

公式中有换算系数，按公式计算后单位即为μg/100g。

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（回放截止到2022年11月27日）