我们在学习和日常检验工作中经常说到的“pH”或“pH值”，其官方定义的名称是氢离子浓度指数（hydrogen ion concentration），它是表示氢离子浓度的一种方法，代表水溶液中氢离子浓度（活度）的常用对数的负值，即-lg[H+]。

培养基是指液体、半固体或固体形式的、含天然或合成成分，用于保证微生物繁殖(含或不含某类微生物的抑菌剂)、鉴定或保持其活力的物质，而培养基的pH值是商品化脱水合成培养基质量控制的重要理化指标之一，微生物的生长不仅依赖丰富的营养，还需要在适宜的pH值范围内才能正常生长繁殖或体现其生化特性。因此，制备好的培养基pH值是否符合要求对于我们微生物检验有很重要的影响。

一、影响培养基pH的因素有哪些呢？

1、培养基的称量和溶解

按照标签用法中称量数称取培养基，根据实验需求调整配制体积。先加适量水，充分混合完全溶解，不可有团块，再加水至所需量。

国内外大多数培养基厂家的用法上都标明：灭菌前需要进行加热煮沸至完全溶解。这是因为加热煮沸后，培养基溶解较为均匀。如果灭菌前未进行加热灭菌，容易导致培养基的pH值变化不稳定，特别是含有琼脂的培养基。

       培养基配制用水应满足GB4789.28-2013中关于水质的要求，如配制用水不佳：偏酸或偏碱，或含离子较多，都可能导致培养基pH值出现偏差。

图1 GB4789.28-2013 3.3.2 水

图2 水质的电阻率

2、培养基的灭菌

应按照培养基标签上的灭菌条件进行灭菌，目前常见的灭菌方式有两种：湿热灭菌（高压灭菌）和煮沸灭菌。

由于市售高压蒸汽灭菌锅性能存在一定差异，且受装载需要灭菌物品的摆放及多少影响，灭菌过程的持续时间会不同。小型灭菌锅或装载较少时，灭菌时间较快，而一些大型灭菌锅或装载较满时，灭菌时间较长。灭菌时间的长短势必会对培养基的pH值造成一定程度的影响，特别是对于一些含糖量较高的培养基，其直接感官表现就是培养基颜色的加深。因此，在使用高压蒸汽灭菌锅时，应进行灭菌工艺验证（定期使用生物指示剂进行验证），且注意装载量及物品分布，灭菌后要采用适当的方式进行冷却，以防过度加热。

图3 KINTEK品牌  

压力蒸汽灭菌生物指示剂（自含式）

3、培养基的保温及复溶

进行倾注的培养基一般灭菌后会进行保温，目前实验室常见的保温设备是水浴锅和保温箱。但长时间的保温会影响培养基的pH值，一般建议在50℃左右不超过4h，最长放置时间不能超过8h。

已凝固的培养基如使用需要复溶（已添加附加实际的培养基不能复溶），但加热的过程相当于增加了培养基的受热时间，培养基的pH值会受到一定程度的影响。因此，复溶后的培养基，pH值不能作为验收依据。

4、测量温度

水的电离受温度影响，加酸、加碱都能抑制水的电离。实验测得，在标准温度（25℃）和压力下，水分子电离出的H⁺和OH⁻数目在任何情况下始终是1×10^-14，且两种离子的浓度都是1×10^-7mol/L ，即pH=7。水的离子积常数定义为K_W=[H⁺]·[OH^-]，其中，K_W称作水的离子积常数，简称水的离子积，K_W只随温度变化而变化，是温度常数。温度升高时，溶液中的离子游离数增多，pH值降低；反之，当温度降低时，离子游离减少，pH值升高。

培养基的pH值指的是灭菌后冷却至25℃时的测量值（GB4789.28-2013）。即便市售有些pH计具备温度补偿功能，也应该以实测温度25±0.5℃时的测量结果为准。

图4 GB4789.28-2013 3.3.4

5、电极

pH电极根据所测样品的种类不同大概有上百种之多，微生物检测实验室常见的有三种，即液体电极、表面电极和固体电极。而受品牌、缓冲溶液配置、校准过程等因素的影响，pH计的准确度也会存在一定的误差，且不可避免。

二、如何正确测量pH值呢？

1、pH计的校正

按仪器使用说明对pH计进行校正。

2、pH值的测定及调整

（1）对样品进行测量前，用去离子水或蒸馏水清洗pH电极并用吸水纸擦干电极；

（2）将电极插入（表面电极需要使电极贴紧琼脂表面）灭菌冷却至25±0.5℃的待测样品中，待显示稳定后，读取样品的测量值，报告小数点后一位；

（3）更换待测样品时，用蒸馏水或去离子水冲洗pH电极并擦干。

（4）必要时在灭菌前进行pH值调整，一般使用浓度约为40 g/L（约1 mol/L）的氢氧化钠溶液或浓度约为36.5 g/L（约1mol/L）的盐酸溶液调整培养基的pH。如需灭菌后进行调整，则使用灭菌或除菌的溶液。

参考标准

1、宋昌彦,施杨,盛满钰.影响培养基pH值稳定性的因素分析[J].中国卫生检验杂志, 2015(9):5.DOI:CNKI:SUN:ZWJZ.0.2015-09-054.

2、赵贵明. 微生物培养基及其原材料质量控制[M].中国质检出版社,2018.

3、徐俊延.高压蒸汽灭菌锅使用中几个应注意的问题[J].食用菌, 2011(3):2.DOI:10.3969/j.issn.1000-8357.2011.03.038.

4、余芬,孙明波,沈伟,等.生物制品生产中6种常用液体培养基高压灭菌前后的pH变化特征分析[J].中国药品标准, 2015(3):5.DOI:CNKI:SUN:YPBZ.0.2015-03-007.

5、BS EN ISO10523:2012  Water quality —Determination of pH

6、GB5009.237—2016  食品pH值的测定

7、GB/T9724-2007  化学试剂pH值测定通则

8、GB/T11165-2005  实验室pH计

9、GB4789.28-2013  培养基和试剂的质量要求