芽孢是细菌的休眠体，当细菌菌体营养缺乏时形成。通常为圆形或椭圆形，位于细菌菌体的一端或者中间。
由于芽孢结构特殊，芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。所以，普通染色方法（如革兰氏染色）只有菌体着色，而芽孢无法着色而呈现无色。
因此，如想要芽孢着色，需要使用着色力强的染色剂（如孔雀石绿）在加热条件下进行染色。染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染色的染料则难以透出，若再用复染液（如番红溶液）染色后，芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色易于区分。
下面以嗜热脂肪芽孢杆菌为例介绍孔雀石绿芽孢染色法的两种操作。
准备合适菌龄的平板，本次实验使用嗜热脂肪芽孢杆菌在胰酪胨大豆琼脂上的48h培养物。多数芽孢尚在菌体中。如果观察大量游离芽孢 ，需要培养至5-7天。
使用5%孔雀石绿作为初染液，番红作为复染液。
1、首先介绍第一种操作，酒精灯直接加热。具体操作如下：
3、用酒精灯外焰加热至冒蒸汽状态，维持10min-15min。注意添加染液，避免干燥。
4、玻片冷却后，用水冲洗至没有浮色。
纵观整个操作过程发现此方法难度较大
载玻片需要持续微沸的状态，手持载玻片时手臂容易疲劳。
载玻片持续处于高温状态，容易发生崩裂的情况，要选择质量更好的载玻片同时注意操作安全。
加热过程中，试剂会有迸溅的情况，注意做好防护措施。
加热完后载玻片染液残留多，不易洗净。可能影响后期镜检观察。
2、由于酒精灯直接加热操作难度比较大，且容易有安全隐患，我们介绍另外一种改良的芽孢染色操作——水浴加热。具体操作如下：
3、将此试管浸于沸水浴 ，加热 15min—20min
4、用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的载玻片上，涂片，晾干。固定；水洗。
改进后的方法，不再使用直接加热载玻片的方式，实验过程更安全，操作更加简便。同时染液的用量大大减少，降低了实验成本。
芽孢染色的方法除以上介绍的两种操作外还有其他的方法，比如微波加热法等。实验室可以酌情使用。
—— —— 染色小贴士 —— ——
●涂片时选择适宜菌量，避免聚团。涂片面积不宜过大，可采用以上操作中使用的带有限位圈的玻片。