编者按：

  夏日炎炎，又到了空调呼呼吹，跳进泳池尽情戏水的季节，我们在享受凉爽的同时，一种“城市文明病”-军团病，也悄悄的潜伏在我们身边。此病到底是什么？引起此病的病原菌应如何检测？今天，小编就来跟大家聊一聊。

    何为军团菌，何为军团病？

1976年美国费城斯特拉福宾馆召开退伍军人大会，会后短期内就有数百人发生细菌性肺炎，共221人发病，34人死亡。当时未查明传染源，按照流行病学分析，可能是聚会宾馆导致，许多宾馆工作人员具有免疫力。后来，从患者组织中分离出一种革兰氏阴性杆菌——嗜肺军团菌，从而发现了一个新的细菌家族成员军团菌属（Legionella）。此次疾病被命名为军团病（Legionnaires’ disease,LD），也称军团菌病（Legionellosis）。

军团菌病症的防治是世界性难题，它的传播途径类似于新冠病毒，自呼吸道侵入人体后，引起肺炎、胸膜炎、呕吐、腹泻、甚至休克和死亡。有报道称军团菌致死率在5%-10%之前，也就是说再不考虑医疗挤兑的情况下，军团菌的致死率高于新冠，甚至接近非典。并且，此菌更易入侵免疫力低下人群，喜欢“专挑软柿子捏”。

    军团菌潜伏在哪里？

军团菌主要存在天然淡水和长时间不流通的人工水环境中，随着社会经济的高速发展，中央空调、冷却塔、热水淋浴器、空气加湿器等不断涌入我们的生活，在给生活带来便利的同时，由于管理不善等因素也成为军团菌散播的工具。尤其疫期间，很多酒店、游泳池都关门停业，场所缺少维护，这就给军团菌提供了繁殖场所。因此，我国公共场所要求监测嗜肺军团菌。

军团菌有哪些特性？

根据伯杰手册第九版分类，军团菌目（Legionellales），军团菌科（Legionellaceae)，军团菌属(Legionella)。目前发现的军团菌属中有58个种，3个亚群，70多种血清型，其中有26种被报道过引起人类感染，而嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)，是引起军团病的主要病原菌。

     军团菌是革兰氏阴性杆菌，无芽孢无荚膜，有鞭毛能运动。专性需氧，普通有氧条件下培养会生长，但若CO₂含量为5%，生长会更好。耐酸耐热，所以对于杂菌较多的样品，常采用酸处理或热处理，提高军团菌检出率。此外军团菌最显著的特点是：嗜铁性和对L-半胱氨酸有绝对的营养需求。因此，在含有L-半胱氨酸的BCYE上生长而在L-半胱氨酸缺失的BCYE上不生长，是初步判断是否是军团菌的重要依据。

 军团菌如何分离培养?

目前公认的最适宜军团菌生长的培养基是活性炭酵母浸出物培养基（简称：CYE）；此培养基基础里加上铁，L-半胱氨酸和α-酮戊二酸，成为BCYE培养基（也称BCYEα）；自然样品和临床样本中存在大量杂菌，故在BCYE基础上添加万古霉素、多粘菌素B和放线菌酮抑制杂菌生长，称为GVPC培养基。也有添加其他抗生素（例如：纳他霉素或先锋霉素，成为GCPN或CCCV等），但效果均不如GVPC。（参考 胡朝晖《军团菌选择性分离培养基及其实用性比较研究》）

军团菌生长缓慢，必须保证10天的充分培养，但可以自第2,3,4,5天开始检查GVPC平板。在GVPC上菌落通常白色、灰色、蓝色或紫色，也有深褐色、灰绿色、深红色菌落，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，部分军团菌有荧光（杜莫夫军团菌、博杰曼军团菌等），但嗜肺军团菌无荧光。

怎样锁定嗜肺军团菌？

GVPC分离出军团菌，BCYE与BCYE-CYS生长试验锁定军团菌属后，如何判断是否是嗜肺军团菌呢？国标中嗜肺军团菌主要四项生化试验是：硝酸盐还原（-）、尿素酶（-）、明胶液化（+）、水解马尿酸（+）。根据表1-军团菌属中各种军团菌生化特征，我们可以看出，马尿酸水解试验阳性，是嗜肺军团菌区分于其他军团菌的重要试验。马尿酸阳性几乎就可以锁定嗜肺军团菌与菲利军团菌。而明胶试验，通常需要培养7~14天，时效性不好，所以马尿酸水解试验，是嗜肺军团菌判断的首选试验。那么问题来了，嗜肺军团菌的马尿酸试验，是使用三氯化铁法还是茚三酮法？具体的试验操作如何呢？为何有人做马尿酸水解试验阳性不明显呢？这些问题国标中都没有答案，笔者来谈谈自己的试验经验。

表1  军团菌属中各军团菌生化

马尿酸水解试验操作要点一：

将0.1g马尿酸生化鉴定试剂，溶于10mLPBS缓冲液中，制成1%含量的马尿酸钠试验管。用过滤除菌法除菌后，分装在1.5mL-2mL无菌离心管中，备用。注意，马尿酸钠试剂不稳定，最好使用近期配制的试剂。

马尿酸水解试验操作要点二：

从BCYE平板上刮取大量军团菌到马尿酸钠试验管中，36℃±1℃水浴培养基4h，注意要水浴培养，培养箱过夜培养效果不如水浴培养效果好。而后加入0.2mL 3.5%茚三酮溶液，36℃±1℃再水浴10min判断结果。出现紫色阳性，无颜色变化为阴性。

重要的事情说三遍：接种大量军团菌，水浴培养！接种大量军团菌，水浴培养！接种大量军团菌，水浴培养！

明胶实验的要点，同样是接种量要大，而后36℃±1℃培养7-14天，从第7天开始观察，每天观察一次，直至出现液化。

之后血清结果，报告嗜肺军团菌结果，这里就不再赘述。

小结，军团菌并不神秘，只是属于营养苛求型细菌，初次分离时对铁和L-半胱氨酸有绝对需求，生长缓慢，因此在平板上培养时间为2-7天或7-14天，25℃到43℃均能生长，最适生长温度36℃。在普通营养琼脂、血平板和BYCE-CYS（缺少L-半胱氨酸）上均不能生长，因此常以BCYE生长、BYCE-CYS不生长作为军团菌属初步确定试验。由于嗜肺军团菌是军团菌属家族中，为数不多的马尿酸水解试验阳性菌，因此马尿酸水解阳性就成为筛选的重要依据，用好这把利器就可以轻松锁定嗜肺军团菌了。